Selezionato dalla NASA nel 1984, Mark Lee ha completato il suo addestramento nel 1985 e ha assunto vari ruoli tecnici, tra cui attività extraveicolari (EVA) e sistemi della Stazione Spaziale. Lee ha servito come comunicatore di veicoli spaziali (CAPCOM) e ha ricoperto diverse posizioni di leadership all'interno dell'Ufficio Astronauti.

La carriera spaziale di Lee comprende quattro missioni, con oltre 13 milioni di chilometri percorsi e 517 orbite intorno alla Terra. Ha volato come specialista di missione su STS-30, dove ha contribuito al dispiegamento della navicella Magellan per l'esplorazione di Venere, la prima missione statunitense di scienza planetaria lanciata dal 1978. Nell'STS-47 ha ricoperto il ruolo di Comandante del carico utile, supervisionando 44 esperimenti giapponesi e statunitensi di scienza della vita e di trattamento dei materiali.

Durante STS-64, ha effettuato la prima passeggiata spaziale non vincolata in un decennio, registrando 6 ore e 51 minuti di EVA. La sua ultima missione, STS-82, è stata la seconda missione di manutenzione del telescopio spaziale Hubble, dove ha effettuato tre passeggiate spaziali per un totale di 19 ore e 10 minuti, installando nuovi spettrometri e strumenti sostitutivi e migliorando l'isolamento del telescopio.

Lee si è ritirato dalla NASA e dall'Aeronautica Militare il 1° luglio 2001.