Selecionado pela NASA em 1984, Mark Lee concluiu seu treinamento em 1985 e assumiu várias funções técnicas, incluindo atividade extraveicular (EVA) e sistemas da Estação Espacial. Lee atuou como comunicador de espaçonaves (CAPCOM) e ocupou vários cargos de liderança no Escritório de Astronautas.

A carreira espacial de Lee inclui quatro missões, viajando mais de 13 milhões de milhas e orbitando a Terra 517 vezes. Ele voou como especialista de missão na STS-30, onde ajudou a implantar a espaçonave de exploração de Vênus Magellan, a primeira missão de ciência planetária dos EUA lançada desde 1978. Na STS-47, atuou como comandante da carga útil, supervisionando 44 experimentos japoneses e norte-americanos de ciências da vida e processamento de materiais.

Durante a STS-64, ele realizou a primeira caminhada espacial sem amarras em uma década, registrando 6 horas e 51 minutos de EVA. Sua última missão, STS-82, foi a segunda missão de manutenção do Telescópio Espacial Hubble, na qual ele realizou três caminhadas espaciais, totalizando 19 horas e 10 minutos, instalando novos espectrômetros e instrumentos de substituição, além de atualizar o isolamento do telescópio.

Lee se aposentou da NASA e da Força Aérea em 1º de julho de 2001.